PCR技術類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性一退火—延伸三個基本反應步驟構成。這個反應過程在PCR反應容器中進行,隨著基因擴增儀的不斷發(fā)展,其反應容器也經(jīng)歷了從1.5ml到0.2ml (0.25m1)的離心管逐步發(fā)展成PCR專用的薄壁的0.2ml,0.1mlpcr管。隨著pcr擴增反應數(shù)量的提高,逐步形成了PCR條、PCR板高通量的基因擴增容器。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成
模板DNA的變性:
模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,以便它與引物結合,為下輪反應做準備。
模板DNA與引物的退火(復性):
模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右后,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。
引物的延伸:
DNA模板——引物結合物在Taq的作用下,以dNTP為反應原料,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。
PCR技術的基本原理
該技術是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下,依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。
DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,借助一小段雙鏈DNA來啟動合成,通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合,形成部分雙鏈。
在適宜的溫度和環(huán)境下,DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端,并以此為起始點,沿模板5′→3′方向延伸,合成一條新的DNA互補鏈。
如何選擇PCR管
1、材質:PCR 耗材一般都是 PP 材質,因為 PCR/qPCR 耗材通常會與試劑或樣品直接接觸,表面不易于粘附生物分子,有良好的化學耐性及溫度耐受性。
2、PCR 管/板體積:依據(jù)具體的實驗要求選用合適的產(chǎn)品。單管和聯(lián)管是兩種最常用的形式。
3、管蓋選擇:單管和連管都有平蓋和凸蓋之分,而平蓋和凸蓋各有優(yōu)點。平蓋適用于熒光定量PCR。
4、管壁厚度:管壁厚度會直接影響熱傳導率,極薄的壁厚可優(yōu)化熱傳遞減少循環(huán)時間。進一步減少了熱障,從而帶來更快,更穩(wěn)健的反應。
5、顏色:PCR板通??商峁┒喾N不同的顏色形式,透明的 PCR 管更有助于進行樣品分類管理。白色 PCR 產(chǎn)品可最大程度地反射熒光信號,減少孔間信號交叉污染,可優(yōu)化實時熒光定量 PCR 的結果。不同品牌儀器,由于熒光檢測器位置設計不同,請參考生產(chǎn)廠家推薦的耗材。
(文章來源于互聯(lián)網(wǎng))