熒光定量ＰＣＲ　實驗步驟：

①取凍存已裂解的細胞，室溫放置５分鐘使其完全溶解。

②兩相分離　每１ｍｌ的ＴＲＩＺＯＬ試劑裂解的樣品中加入０．２ｍｌ的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體１５秒后，１５到３０℃孵育２到３分鐘。４℃下１２０００ｒｐｍ離心１５分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。ＲＮＡ全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的ＴＲＩＺＯＬ試劑的６０％。

③ＲＮＡ沉淀　將水相上層轉移到一干凈無ＲＮＡ酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的ＲＮＡ，混勻后１５到３０℃孵育１０分鐘后，于４℃下１２０００ｒｐｍ　離心１０分鐘。此時離心前不可見的ＲＮＡ沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。

④ＲＮＡ清洗　移去上清液，每１ｍｌＴＲＩＺＯＬ試劑裂解的樣品中加入至少１ｍｌ的７５％乙醇（７５％乙醇用ＤＥＰＣＨ２Ｏ配制），清洗ＲＮＡ沉淀?；靹蚝螅础嫦拢罚埃埃埃颍穑黼x心５分鐘。

⑤ＲＮＡ干燥　小心吸去大部分乙醇溶液，使ＲＮＡ沉淀在室溫空氣中干燥５－１０分鐘。

⑥溶解ＲＮＡ沉淀　溶解ＲＮＡ時，先加入無ＲＮＡ酶的水４０μｌ用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的ＲＮＡ溶液保存于－８０℃待用?！。保┳贤馕辗y定

先用稀釋用的ＴＥ溶液將分光光度計調零。然后取少量ＲＮＡ溶液用ＴＥ稀釋（１：１００）后，讀取其在分光光度計２６０ｎｍ和２８０ｎｍ處的吸收值，測定ＲＮＡ溶液　濃度和純度。

①　濃度測定

Ａ２６０下讀值為１表示４０　μｇ　ＲＮＡ／ｍｌ。樣品ＲＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）計算公式為：Ａ２６０　×稀釋倍數×　４０　μｇ／ｍｌ。具體計算如下：

ＲＮＡ溶于４０　μｌ?。模牛校盟?，?。担酰?，１：１００稀釋至４９５μｌ的ＴＥ中，測得Ａ２６０　＝?。埃玻?/p>

ＲＮＡ　濃度＝?。埃玻薄　粒保埃啊　粒矗啊ˇ蹋纾恚臁。健。福矗啊ˇ蹋纾恚臁』颉。埃福础ˇ蹋纾蹋?/p>

?。担酰煊脕頊y量以后，剩余樣品ＲＮＡ為３５　μｌ，剩余ＲＮＡ總量為：

３５　μｌ　×　０．８４　μｇ／μｌ?。健。玻梗础ˇ蹋?/p>

②純度檢測

ＲＮＡ溶液的Ａ２６０／Ａ２８０的比值即為ＲＮＡ純度，比值范圍１．８到２．１。

２）變性瓊脂糖凝膠電泳測定

①制膠

１ｇ瓊脂糖溶于７２ｍｌ水中，冷卻至６０℃，１０?。恚斓模保啊痢。停希校与娪揪彌_液和１８?。恚斓模常罚ァ〖兹┤芤海ǎ保玻场。停?。

１０×ＭＯＰＳ電泳緩沖液

濃度　成分

０．４Ｍ?。停希校樱穑取。罚?/p>

０．１Ｍ　乙酸鈉

０．０１Ｍ?。牛模裕?/p>

灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入２５　μｌ溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的１×ＭＯＰＳ電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

②準備ＲＮＡ樣品

取３μｇＲＮＡ，加３倍體積的甲醛上樣染液，加ＥＢ于甲醛上樣染液中至終濃度為１０μｇ／ｍｌ。加熱至７０℃孵育１５分鐘使樣品變性。

③電泳

上樣前凝膠須預電泳５ｍｉｎ，隨后將樣品加入上樣孔。５–６Ｖ／ｃｍ電壓下２ｈ，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少２–３ｃｍ。

④紫外透射光下觀察并拍照

２８Ｓ和１８Ｓ核糖體ＲＮＡ的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提ＲＮＡ的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的２倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的ＲＮＡ（ｔＲＮＡ和５Ｓ核糖體ＲＮＡ）組成。在１８Ｓ和２８Ｓ核糖體帶之間可以看到一片彌散的ＥＢ染色物質，可能是由ｍＲＮＡ和其它異型ＲＮＡ組成。ＲＮＡ制備過程中如果出現ＤＮＡ污染，將會在２８Ｓ核糖體ＲＮＡ帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，ＲＮＡ的降解表現為核糖體ＲＮＡ帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果?！、俜磻w系　序號　反應物　劑量?。薄∧孓D錄ｂｕｆｆｅｒ　２μｌ?。病∩嫌我铩。埃拨蹋臁。场∠掠我铩。埃拨蹋臁。础。洌危裕小。埃宝蹋臁。怠∧孓D錄酶ＭＭＬＶ　０．５μｌ?。丁。模牛校盟。郸蹋臁。贰。遥危聊０妗。拨蹋臁。浮】傮w積?。保唉蹋臁≥p彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。

②混合液在加入逆轉錄酶ＭＭＬＶ　之前先７０℃干?。撤昼?，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶０．５μｌ，３７℃水?。叮胺昼姟?/p>

③取出后立即９５℃干?。撤昼姡玫侥孓D錄終溶液即為ｃＤＮＡ溶液，保存于－８０℃待用?！」芗一颍é拢幔悖簦椋睿崟r定量ＰＣＲ

①β－ａｃｔｉｎ陽性模板的標準梯度制備　陽性模板的濃度為１０１１，反應前取３μｌ按１０倍稀釋（加水２７μｌ并充分混勻）為１０１０，依次稀釋至１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４，以備用。

②反應體系如下：

標準品反應體系　序號　反應物　劑量　１?。樱伲拢摇。牵颍澹澹睢。薄∪玖稀。保唉蹋臁。病￡栃阅０迳嫌我铮啤。埃郸蹋臁。场￡栃阅０逑掠我铮摇。埃郸蹋臁。础。洌危裕小。埃郸蹋臁。怠。裕幔衩浮。宝蹋臁。丁￡栃阅０澹模危痢。郸蹋臁。贰。洌洌龋玻稀。常玻郸蹋臁。浮】傮w積?。担唉蹋臁≥p彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。

管家基因反應體系：　序號　反應物　劑量?。薄。樱伲拢摇。牵颍澹澹睢。薄∪玖稀。保唉蹋臁。病葏⒄丈嫌我铮啤。埃郸蹋臁。场葏⒄障掠我铮摇。埃郸蹋臁。础。洌危裕小。埃郸蹋臁。怠。裕幔衩浮。宝蹋臁。丁〈郎y樣品ｃＤＮＡ?。郸蹋臁。贰。洌洌龋玻稀。常玻郸蹋臁。浮】傮w積?。担唉蹋臁≥p彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。

③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：９３℃２分鐘，然后９３℃?。狈昼?，５５℃　２分鐘，共４０個循環(huán)?！、籴槍γ恳恍枰獪y量的基因，選擇一確定表達該基因的ｃＤＮＡ模板進行ＰＣＲ反應。

反應體系：　序號　反應物　劑量?。薄。保啊粒校茫揖彌_液?。玻怠。酰臁。病。停纾茫欤踩芤骸。保怠。酰臁。场∩嫌我铮啤。埃怠。酰臁。础∠掠我铮摇。埃怠。酰臁。怠。洌危裕谢旌弦骸。场。酰臁。丁。裕幔窬酆厦浮。薄。酰臁。贰。悖模危痢。薄。酰臁。浮〖铀量傮w積為?。玻担酰臁≥p彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。

３５個ＰＣＲ循環(huán)（９４℃１分鐘；５５℃１分鐘；７２℃１分鐘）；?。罚病嫜由欤捣昼姟?/p>

②ＰＣＲ產物與?。模危痢。蹋幔洌洌澹蛟冢玻キ傊悄z電泳，溴化乙錠染色，檢測ＰＣＲ產物是否為單一特異性擴增條帶。

③將ＰＣＲ產物進行１０倍梯度稀釋：　設定ＰＣＲ產物濃度為１×１０１０，依次稀釋至１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４幾個濃度梯度?！、偎校悖模危翗悠贩謩e配置實時定量　ＰＣＲ反應體系。

體系配置如下：　序號　反應物　劑量?。薄。樱伲拢摇。牵颍澹澹睢。薄∪玖稀。保啊。酰臁。病∩嫌我铩。保酰臁。场∠掠我铩。保酰臁。础。洌危裕小。保酰臁。怠。裕幔窬酆厦浮。玻酰臁。丁〈郎y樣品ｃＤＮＡ?。担酰臁。贰。洌洌龋玻稀。常埃酰臁。浮】傮w積?。担啊。酰臁≥p彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。

②將配制好的ＰＣＲ反應溶液置于Ｒｅａｌｔｉｍｅ?。校茫覂x上進行ＰＣＲ擴增反應。反應條件為：９３℃２分鐘預變性，然后按９３℃?。狈昼?，５５℃１分鐘，７２℃１分鐘，共４０做個循環(huán)，最后７２℃７分鐘延伸?！「鳂悠返哪康幕蚝凸芗一蚍謩e進行Ｒｅａｌｔｉｍｅ?。校茫曳磻?。ＰＣＲ產物與　ＤＮＡ?。蹋幔洌洌澹蛟冢玻キ傊悄z電泳，ＧｏｌｄＶｉｅｗ染色，檢測ＰＣＲ產物是否為單一特異性擴增條帶。

（文章來源于互聯(lián)網）